大片段外源基因的定点敲入，是疾病模型构建、基因治疗和合成生物学中的关键技术瓶颈。目前此类操作主要依赖同源定向修复（HDR）通路，但HDR效率普遍偏低，当涉及数千乃至上万碱基对的大片段时，高效精准整合尤为困难。不仅如此，常规CRISPR/Cas9在引入DNA双链断裂后，常伴随靶点及脱靶位置的非预期插入/缺失（indel），给基因编辑的安全性带来隐忧。如何在提高大片段敲入效率的同时，降低修复错误引入的遗传毒性，是该领域亟待突破的难题。

近日，东北农业大学生命科学学院刘忠华和宋军团队在美国基因与细胞治疗学会（ASGCT）《Molecular Therapy》（中科院一区top，IF：12.698）杂志发表了题为“A Helicase-Fused Cas9 improves Large-Size Fragment Knock-in”的研究论文。该研究报道了一种名为MCCas的新型融合蛋白，将真核生物MCM2-7解旋酶复合物的核心亚基MCM5与SpCas9的N端连接，显著提高了多种人类细胞系中多个位点的敲入效率，明显优于SpCas9。值得注意的是，MCCas实现了高达10 kb大小供体模板的高效敲入。与SpCas9介导的敲入相比，MCCas介导的长片段敲入还表现出靶向和非靶向indel事件频率更低的特点。

研究团队首先系统构建了不同连接肽长度和MCM5结合位置的MCM5-Cas9变体，从中筛选出效率最高的MCM5-Linker C-Cas9（即MCCas），并结合自剪切供体在多细胞系多位点提高外源基因的敲入效率。

在此基础上，团队进一步探索MCCas是否可以实现大片段高效精准敲入。结果显示，使用MCCas系统在人基因组中可实现最大10 kb外源序列的高效精准敲入。更关键的是，深度测序分析表明，与SpCas9相比，MCCas在实现高效敲入的同时，其靶位点的on-target indel频率显著下降，且未引入额外脱靶风险。这表明MCCas具有更高的安全性，更适合应用于对安全性要求较高的活体动物实验。

在应用层面，研究团队将MCCas系统充分应用于模式动物构建。将MCCas系统注射入兔胚胎，成功实现了3.4 kb的hACE2基因CDS区精准整合，并直接获得F0代基因编辑兔。相比传统HDR方法，MCCas的效率优势得到充分证实，展示了该系统在复杂基因组编辑和模式动物快速构建中的巨大潜力。

关于MCCas的性能来源，研究发现该融合蛋白能够促使细胞内修复机制向HDR方向偏移；同时结合自剪切供体模板的设计，进一步放大了长片段精确敲入能力，减少了意外突变。在人类细胞系和兔子胚胎中的成功应用，证明了这种工具在复杂基因组编辑中的广泛适用性，也为后续新型编辑工具的改良提供了方向。

东北农业大学宋军教授、刘忠华教授、尹智高级工程师为论文通讯作者，博士研究生赵多维、赵祥杰、硕士研究生高雨杭为共同第一作者。该研究得到国家自然科学基金项目资助。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2026.07.049

（供稿/生命科学学院）